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酶聯生物ELISA技術大詳解
发布时间:2019-07-15   点击次数:8次

ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性,酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性,又保留酶的活性。

這種測定方法中有三個必要的試劑:

(1)固相的抗原或抗體,即"免疫吸附劑"(immunosorbent)

(2)酶標記的抗原或抗體,稱爲"結合物"(conjugate)

(3)酶反應的底物。根據試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件,可設計出各種不同類型的檢測方法

 

雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法。

操作步驟如下:

1) 將特異性抗體與固相載體聯結,形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。

2) 加受檢標本,保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合,形成固相抗原抗體複合物。洗滌除去其他未結合物質。

3) 加酶標抗體,保溫反應。固相免疫複合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。

4) 加底物顯色。固相上的酶催化底物成爲有色産物。通過比色,測知標本中抗原的量。

 

雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原,但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原,因其不能形成兩位點夾心。

【雙抗夾心法測抗體】

反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物,以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處爲以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需稀釋,可直接用于測定,因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常采用本法。本法關鍵在于酶標抗原的制備,應根據抗原結構的不同,尋找合適的標記方法。

【直接法測抗體】

間接法是檢測抗體常用的方法。其原理爲利用酶標記的抗抗體(抗人免疫球蛋白抗體)以檢測與固相抗原結合的受檢抗體,故稱爲間接法。

 

操作步驟如下:

1)將特異性抗原與固相載體聯結,形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。

2)加稀釋的受檢血清,保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合,形成固相抗原抗體複合物。經洗滌後,固相載體上只留下特異性抗體,血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。

3)加酶標抗抗體。可用酶標抗人Ig以檢測總抗體,但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗體。固相免疫複合物中的抗體與酶標抗體抗體結合,從而間接地標記上酶。洗滌後,固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。

4)加底物顯色

本法主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。

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